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激光共聚焦显微镜
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任何显微镜的目的都是为了生成高对比度、高分辨率的图像。望远镜可以让科学家分辨出宇宙最精细的细节,与此相同,显微镜可以让我们以纳米的尺度观察生物机能。现代激光扫描显微镜能够生成多维数据(X、Y、Z、τ、λ),其超高分辨率的成像能力促进了人们对基础生物学过程的理解。

在传统的宽场显微镜(图1)中,只有在使用较薄样品(一般只有一层或两层细胞的厚度)时才能获得高质量的图像。然而,很多应用都要求对较厚样品进行成像,并要求获得特定焦平面附近的体数据集或选择区域数据。传统的宽场显微镜是不能满足这些要求的。

LSM,特别是共焦激光扫描显微(CLSM)和多光子激光扫描显微(MPLSM),能够观察厚块状样品中的薄平面,该技术被称为光学切片。在共焦LSM中,在焦平面以外样品产生的信号被一个光阑遮挡住,防止其被探测。多光子LSM,正如我们之后将讨论的,它不会生成任何焦平面以外的可探测信号。 通过将光学切片和焦平面的递增变化相结合(图2),激光扫描显微技术能够产生厚样品的三维形貌。

 

图 1 宽场Epi-荧光

Wide Field Epi-Fluorescence
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图 2 光学切片(厚块状样品中薄平面的可视化)

共聚焦中的光学切片

Optical Sectioning in Confocal Microscopy
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多光子中的光学切片

Optical Sectioning in Multiphoton Microscopy
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样品产生的信号为绿色所示。光学切片是通过直接测量特定焦平面上产生的信号而生成的。在共焦LSM中,离焦光信号将被针孔光阑所遮挡,这样就可以得到更高的分辨率。相对地,在多光子显微技术中,只有焦平面位置的样品才会产生信号。每个光学切片的光信号都可以重新结合构成一幅三维图像

 

LSM的对比机制

生物样品往往没有良好的对比度,导致很难区分相邻结构之间的界线。改善激光扫描显微镜对比度的常用方法通过采用荧光的方法。

在荧光照明中,发光分子用来将感兴趣的部分与背景或相邻结构区分开来。这种发光分子可以预先存在于样品中(内源性或自体荧光),外涂并附加到样品组分上(化学构成或通过抗体结合),或感染(荧光蛋白)到细胞之中。

为了使分子发出光线(荧光),分子必须先获得适当能量的光(光子),从而使分子从基态变为激发态,如图3A所示。当分子返回基态时,就会发出荧光。发出荧光的强度与入射激光光强(I)成比例,因此共焦LSM通常被认为是一种线性成像技术。在该释放过程中具有自然损耗,因此发射光子的能量较低,即,发射光子的波长比吸收光子长。

分子的多光子激发(MPE,图3B)在两个或更多光子同时到达并且其能量总和满足跃迁能量时才会发生。 因此,到达的两个光子的能量将低于发射荧光光子的能量。

多光子LSM技术还可以使用非吸收过程实现对比机制,如倍频及合频。在允许谐波产生的情况下,多个入射光子将同时湮灭并产生一个新的光子,其能量是之前所有光子的能量总和,如图3C所示。

通过观察谐波产生的物理顺序,我们可以进一步地分辨样品组分。在二次谐波产生(SHG)过程中,信号只在高度有序、缺乏反演对称性的组分中产生。三次谐波(THG)只能在折射率变化的边界界面才能观察到。双光子激发和SHG都是非线性过程,其信号的产生取决于光强的平方(I2)。

多光子显微技术中信号产生的非线性特性要求光子的密度要比较高,这样才能进一步观察二次和三次谐波。为了克服这个问题,并且保持样品上相对较低的平均功率,锁模飞秒脉冲激光器,特别是蓝宝石激光器,成为了标准的激发光源。

非线性显微技术中还需要考虑的另一个问题是某个特定荧光团对应的激发波长。有人可能认为,理想的激发波长是单光子吸收峰值波长的两倍。然而对于大多数荧光团而言,单光子和双光子吸收对应的激发态选择规则是不同的。

这样就导致双光子吸收光谱与对应单光子情形大不一样。双光子吸收光谱一般会非常宽(大概>100纳米),并且不会平滑地遵循半高斯曲线。许多荧光团的宽双光子吸收光谱通过单个激光器促进了一些荧光分子的激发,这样就可以同时观察样品中的许多组分。

所有活跃的荧光团不必具有相同的激发峰,但它们的激发光谱之间应互相交叠并拥有相同的激发范围。多重荧光团激发通常通过选择一个能够以可接受的效率活跃所有荧光团的折中波长来实现。

 

图 3 激光扫描显微技术中的信号产生

吸收过程(A, B):

单个或多个激发光子(λEX)的吸收可以将分子从基态(S0)激发到激发态(S1)。当分子回到基态时,分子就会发出荧光(λEM

非吸收过程(C):

多个激发光子(λEX)同时转化为单个光子(λSHG,THG),其能量等于之前所有光子的总和并且波长是之前光子的一半(SHG)或三分之一(THG)

Non-Radiative Energy Losses

 

图像形成

在一个点扫描LSM中,单幅平面图像是通过点光源对样品上一个个衍射极限点成像然后再成像到一个点探测器上而产生的。在样品上逐点扫描衍射极限点构成线,然后将这些扫描的线结果按顺序排列就构成了一幅二维图像。

被照明的部分发出信号,然后成像到单个基元探测器上。这种最常见的单个基元探测器是一个光电倍增管(PMT),然而,在某些情况下可以采用雪崩二极管(APD)。尽管CCD相机可用于多焦距(即旋转盘共聚焦)应用,但它通常不用于点扫描显微镜。

探测器采集到的信号将传递到一台计算机上,通过计算机可以生产一幅由样品上各个扫描点光强阵列构成的二维图像。由于没有生成实像,LSM被认为是一种数字图像技术。单点扫描和单点探测技术的一个显著优势是显示的图像分辨率、光学分辨率和扫描场都可以通过设置来匹配特定的实验要求,而不会被系统的成像光学器件预先确定。

图 4 共聚焦光路

Confocal Optical Path

共聚焦激光扫描显微镜

在共焦LSM技术中,点照明是实现光学切片的关键特性,通常是单模光线耦合的CW激光。单模光线线芯发出的光被准直后,被用作扫描照明光束。然后扫描系统被成像到物镜后光阑上,该物镜将扫描光束聚焦到样品上衍射极限点上。聚焦照明光束产生的信号被物镜收集后会穿过扫描系统。

随着扫描系统信号将通过分色镜从照明光束分离出来,并被聚焦。共焦针孔就位于这个焦点上。在这种结构中,焦平面以上或以下的信号在穿过针孔时会被挡住,这样就生成了一幅光学切片图像(请参看图2)。探测器位于共焦针孔之后,如图4所示。可以推断出,针孔的尺寸会直接影响共焦显微镜的成像能力(特别是对比度、分辨率和光学切片厚度)。

共焦显微镜的横向分辨率定义为系统在样品上生成衍射极限点的能力。衍射极限点的构成取决于激光光束的质量和扫描光学元件、物镜的质量。

光束质量一般可以通过使用一个单模光纤传递激发激光来保证,这样的单模光纤就构成了一个高斯点光源,然后将该点光源准直为一束衍射极限光束。在一个用最高质量的光学元件构成的无像差的成像系统中,假设均匀照明,聚焦光斑的尺寸是激发波长和物镜数值孔径(NA)的函数,如公式1所示。

Spot Size

公式 1 光斑尺寸

事实上,光束并没有真正被聚焦为一个点,而是呈现一系列同心环,被称之为艾里斑。光斑的尺寸是艾里斑第一零级之间的距离(围绕同心环中心的第一个亮环的中心直径), 并被称为一个艾里单位(AU)。这在之后我们讨论针孔尺寸时很重要。

成像系统的横向分辨率是由将两个点分辨为两个不同个体所需的最小距离决定的。在共聚焦(和多光子)激光扫描显微镜中,根据每个点观察到的半峰全宽(FWHM)来定义横向分辨率是常见的,且便于实验。

根据半峰全宽的定义,在共聚焦激光扫描显微镜中,横向分辨率(Rlateral,confocal) 为:

Lateral Resolution, Confocal

公式 2 横向分辨率,共聚焦LSM

且纵向分辨率(Raxial,confocal) 为:

Axial Resolution, Confocal

公式 3 纵向分辨率,共聚焦

其中n为浸没介质的折射率。

有趣的是,在一个共焦显微镜中,横向分辨率只由激发波长决定。这与宽场显微技术是相反的,宽场显微技术的横向分辨率只由发射发射决定。

为了确定共焦针孔的合适尺寸,我们必须将激发光斑尺寸乘以显微镜的总放大率:

Pinhole Diameter

公式 4 针孔直径

例如,一个数值孔径NA=1.0的60X物镜,采用488纳米激发波长(Thorlabs公司的共焦扫描头的放大率为Mscanhead = 1.07),其合适的针孔尺寸为38.2微米,可计为一个1AU直径的针孔。如果我们使用同样的物镜参数,但将其放大倍率改为40X,合适的针孔尺寸将变为25.5微米,这同样也是一个1AU直径的针孔。因此以AU计量针孔直径是将针孔直径归一化的方法,尽管在需要为两种不同物镜选择针孔时也是适用的。

理论上,共焦显微镜的总分辨率是激发照明点光源尺寸和探测针孔尺寸的函数。这表示光学系统的分辨率可以通过减小针孔的尺寸来提高。实际上,当我们限制针孔的直径时我们可以改善分辨率和共焦特定,但是,我们将减小探测器接收到的信号强度。1AU的针孔能够很好地平衡信号强度、分辨率和共焦特性。

图 5 多光子光路

Multiphoton Optical Path

多光子激光扫描显微镜

在多光子LSM技术中,短脉冲自由空间激光提供了穿过扫描系统的准直照明光束,并被物镜进行聚焦。由于信号取决于入射光光强的平方I2,多光子吸收事件发生的几率低,这保证了有效信号被限制在物镜的焦平面上。因此,在焦平面以上或以下的区域几乎不会产生信号。这样就有效地消除了离焦信号,从而不需要共焦针孔就可以具有光学切片的能力(请参看图2)。这还意味着信号采集不再需要穿回到扫描系统,使得探测器可以尽可能地靠近物镜,从而将信号采集效率最大化,如图5所示。在信号穿回扫描系统之前收集信号的探测器被称为退扫描探测器。 

再次使用半峰全宽的定义,在多光子激光扫描显微镜中,横向分辨率(Rlateral,multiphoton) 为:

 Lateral Resolution, Multiphoton

公式 5 横向分辨率,多光子

并且纵向分辨率 (Raxial,multiphoton) 为:

Axial Resolution, Multiphoton

公式 6 纵向分辨率,多光子LSM

这些公式中假设物镜的NA > 0.7,这是几乎所有的多光子物镜的真实值。

多光子激发的波长越长,将导致(参考公式5)在多光子激光扫描显微镜(和共聚焦激光扫描显微镜相比)中的分辨率将以两倍的因子减小。对于一个理想的点物(即一个亚分辨率尺寸的荧光微球)而言,信号对I2依赖性减小了有效焦距,不只是补偿聚焦照明点光源增大的2倍因子。

我们应该注意的是,横向分辨率和轴向分辨率具有相同的光强决定特性。激光功率越高,在衍射极限焦平面内产生信号的几率就越大。实际上,多光子显微镜的横向分辨率由照明光最终能被聚焦为多小的光斑所限制,并且在中等光强下可以由瑞利判据(公式5)进行较准确地估算。轴向分辨率会随着激发光功率的增加而持续减小。

 

成像显示

尽管我们不直接渲染一幅图像,但考虑像场尺寸、屏幕上显示图像(采集分辨率)的像素多少和成像系统的横向分辨率仍然十分重要。我们使用横向分辨率是因为我们需要渲染一幅图像。为了如实地显示光学系统能够分辨的最精细细节,我们必须适当地匹配分辨率(拍摄和横向)和扫描场。因此,我们的拍摄分辨率必须适当地对光学分辨率进行取样。

在LSM中,我们一般依赖于奈奎斯特采样定理,该定理之处像素尺寸应该等于横向分辨率除以2.3。这表示如果我们采用先前的60X物镜,并且横向分辨率为249 nm(公式2),显示图像的像素尺寸应约为108 nm。因此,对于1024 x 1024像素的拍摄分辨率,样品上的扫描场约为111 μm x 111 μm。应该注意的是,在我们之前例子中的40X物镜在样品中会有相同的扫描场(两种物镜具有相同的NA)。而两种物镜获得的图像之间唯一的区别为我们获取图像时扫描头倾斜的角度不同。

在渲染图像时,有可能不总是需要这么高的分辨率。我们总是可以再图像分辨率、扫描场和拍摄分辨率之间找到一个折中的方案,从而在信号、样品寿命和图像分辨率之间进行平衡。

 

活体细胞成像中需要考虑的问题

LSM技术最引人注目的特性之一就是能够对活体细胞核组织进行成像。不幸的是,一些荧光的副产品可能具有毒性。正因为如此,产生高质量的图像和保持细胞活性之间有一种微妙的平衡

荧光团饱和度是一个需要重点考虑的问题。 当增大激光功率不会带来荧光信号的预期同步增长时会发生荧光团饱和。只有10%的荧光团在活激发态时会发生这种情况。

发生饱和是因为荧光团在被激发后回到基态需要一定时间。而荧光通路则相对较快(几百皮秒到几纳秒),这只是指一次跃迁机制的时间。三重态转换和非辐射衰变则需要明显更长的弛豫时间。如果荧光产生较慢,细胞有其自身的内部机制来处理与荧光相关的细胞毒性。

减小光漂白和相关细胞毒性的一种方法是采用快速扫描的方式。若减少激光停留在图像上每个点的时间,探测信号的强度也会减小,通过使荧光团在激光扫描回之前扫描的点之前完全返回基态还会减少一些漂白过程。如果最快的速度不是关键问题,也可以平均几线或整帧图像来弥补更短积分时间造成的信号损失。

更长的激发波长和MPLSM的非退检测探测能力可以对生物组织中更深的位置进行成像。较长的波长不容易被样品散射,这是由于散射光强和波长的四次方成反比(I-4)的缘故。典型的穿透深度约为250 - 500微米,但是,对于共焦LSM技术而言,已报道的成像深度最深可达~100 μm。